ETR1…………………………………………………….……………………Ethylene Resistant
ERS…………………………………………………………..………..Ethylen Response Sensor
EIN…………………………………………………………………..………Ethylene Insensitive
FDA………………………………………………………………….……Floresence Di Acetate
Hsp…………………………………………………………………….……..Heat shock protein
MCP………………………………………………………………….….Methyl - Cyclopropene
MS…………………………………………………………………….…..Murashing and Skoog
MVG……………………………………………………………………. Methoxy Vinyl Glycine
mm…………………………………………………………………….……………….mili meter
NBD………………………………………………………………….………..۲-۵ nor boradiene
nm…………………………………………………………………….……………….nano meter
ppm………………………………………………………………………..………part per million
PVP……………………………………………………………………..…..Poly Vinil Pyrolidon
ROS…………………………………………………………………….Reactive Oxygen Species
SAM…………………………………………………………………….S-adenosyl-L-methionine
SDS………………………………………………………………..……Sodium Dodecyl Sulfate
SDS-PAGE…………………. Sodium Dodecyl Sulfate- Poly Acrylamide Gel Electrophoresis
STS………………………………………………..……………………..….Silver thio sulphate
TEMED…………………………………………….N, N, N, N Tetra methyl ethylene di amine
Tris……………………………………………………..tris- (hydroxyl methyl) amino methane
چ

فصل اول
مقدمه و بررسی منابع
۱-۱ سیب زمینی و اهمیت غذایی و دارویی آن
سیب زمینی (Solanum tuberosum L.) یکی از ۹۰۰ گونه جنس Solanum از خانواده Solanaceae که از نظر اقتصادی و غذایی دارای اهمیت زیادی می باشد(Orczyk et al., 2003). به عنوان چهارمین محصول مهم غذایی انسان بعد از گندم، ذرت و برنج قرار دارد (Orczyk et al., 2003). این گیاه در نواحی آب و هوایی از معتدل گرفته تا استوایی و از مرطوب تا خشک کشت می شود (Bajaj, 1989) این محصول که در حدود ۸۰۰۰ سال پیش توسط بومیان منطقه آمریکای لاتین در بولیوی و پرو کشت می شده، در اواخر قرن ۱۶ میلادی توسط اسپانیایی ها از کوه آند در آمریکای جنوبی به اروپا منتقل و سپس نقش مهمی در تغذیه مردم اروپا به دست آورد و پس از آن ملوانان اروپایی آن را از طریق مرزهای آبی به سایر نقاط جهان معرفی نمودند.(Ortiz and Human, 2001)
خانواده ی سیب زمینی دارای ۹۰ جنس و بیش از ۳۰۰۰ گونه است که اعضای آن در سرتاسر جهان پراکنده اند، ولی اغلب آنها در مناطق آند و آمازون و آمریکای جنوبی متمرکز شده اند. گونه های این خانواده از نظر اکولوژیکی تنوع قابل ملاحظه ای داشته به گونه ای که گستردگی این محصول جنگل های بارانی، کوه های بلند با دمای زیر صفر و بیابانهای بدون باران را هم شامل می شود (Bohs and Olmsteed, 1997). اهمیت سیب زمینی به عنوان غذا به حدی است که سال ۲۰۰۸ میلادی از سوی سازمان ملل متحد به عنوان سال بین المللی سیب زمینی نام گذاری شد^[۱].
سیب زمینی دارای گلیکوآلکالوئیدها، ترکیبات سمی (Solomine, Chaconine) است، این ترکیبات که به طور عمده در برگ ها، ساقه ها و جوانه ها تجمع می یابند گیاه را در برابر مهاجمین محافظت می نماید (Happala, 2005). کربوهیدرات غالب در سیب زمینی به صورت نشاسته است که که بخشی از این نشاسته نسبت به هضم آنزیمی در روده کوچک و شکم انسان مقاوم بوده و تا حدی اثرات فیزیولوژیکی آن مانند فیبر است و برای پیشگیری از سرطان کلون، بهبود تحمل گلوکز و حساسیت به انسولین، کاهش غلظت تری گلیسیرید و گلسترول پلاسما پیشنهاد می گردد.(Hylla et al., 1998)

بیش از ۲۰۰ گونه طبیعی از جنس Solanum تولید کننده غده در جهان وجود دارد اما Solanum toberosom L. یکی از اصلی ترین و بزرگ ترین گونه های سیب زمینی تتراپلوئید و ۴ دارای ۴۸ کروموزوم (۴n=4x=48) می باشد (Ortiz and Human, 2001). در مطالعه حاضر از تکنیک کشت بافت گیاهی که به عنوان ابزاری مفید برای مطالعه فیزیولوژی سلولهای گیاهی محسوب می گردد (شجاعی، ۱۳۸۷) استفاده شد.
۱-۲ کشت بافت، جداسازی و کشت پروتو پلاست سیب زمینی
ارزش سیب زمینی از منظر غذایی، دارویی و صنعتی بسیار چشمگیر و قابل توجه است. این گیاه همانند بسیاری از گیاهان در معرض آسیب توسط آفات و بیماری های قرار گرفته (Torabi et al., 2008) و هر ساله درصد بالایی از محصول آن از بین می رود. استفاده از فن آوری کشت بافت گیاهی، دسترسی به گیاهانی سالم و عاری از بیماری و عوامل بیماری زا و نیز دست یابی به اصطلاحات ژنتیکی را ممکن ساخته است (احسان پور و حسن زاده، ۱۳۷۹). زیست شناسی مولکولی نوین و ابزارهای کشت سلول و بافت گیاهی، دانشمندان را قادر به درک بهتر چگونگی و روند تولید، رشد، محصول دهی، واکنش در برابر آفات و بیماری ها و پاسخ به تنش های محیطی در سیب زمینی نموده است.
کشفیات اخیر در زمینه ژنتیک گیاهی، فیزیولوژی، استفاده از تکنولوژی DNA نوترکیب، مارکرهای مولکولی و حفظ دراز مدت در شرایط in vitro فرصت ها و دست آوردهای نوینی را در صنعت تولید سیب زمینی و ترانسفرماسیون آن پیش روی انسان قرار داده است (Haapala, 2008).
استفاده از کشت سلول و القائات مصنوعی و انتقال ژن ها منجر به ایجاد موتانت های گیاه سیب زمینی مقاوم به Phythophthora infestamse و Fusarium oxysparium گشته است (Torabi et al., 2008).
یکی از بزرگترین و مهم ترین نوآوری ها در صنعت تولید سیب زمینی در دهه ۷۰ با ابداع ریز ازدیادی^[۲] در کشت بافت گیاهی در کشورهای پیشرفته رخ داد و تبدیل به ابزار قدرتمندی در تولید مینی تیوبرهای عاری از ویروس با کیفیت غذایی بهتر و بیشتر در شرایط استریل و کنترل شده گردید (Haapala, 2008). سیب زمینی یکی از اولین محصولات زراعی است که جهت تولید هیبریدهای سوماتیک در شرایط in vitro به کار رفته است.(Orczyk et al., 2003)
۱-۳ جداسازی، کشت وکاربرد پروتوپلاست در گیاهان
پروتوپلاستهای گیاهی یک سیستم سلولی منفرد منحصر به فرد را در بیوتکنولوژی جدید به وجود آورده است. پیشرفتهای مهمی در ژنومیک، پروتئومیک و متابولومیک با این سلولهای فاقد دیواره شکننده به دست‌ آمده است. در حال حاضر می توان پروتوپلاست از گیاهان تک لپه و دو لپه جداسازی کرد. شاخص های مختلف مخصوصاً بافت منبع، محیط کشت و فاکتورهای محیطی بر توانایی پروتوپلاست ها، قدرت توتی پوتنسی^[۳] و تبدیل شدن به یک گیاه کامل اثر می گذارد(Davey et al., 2005). یکی از موارد استفاده و کاربرد کشت بافت گیاهی برای تغییر ژنهای سلولهای گیاهی و یا انتقال ژنهای ایجاد کننده صفات مطلوب و مورد نظر در گیاهان می باشد. از آنجائی که تعداد زیادی از گیاهان بدلایل متعدد از جمله ناسازگاری، عقیم بودن پرچم و مادگی و یا سقط جنین در بذر قادر به انجام گرده افشانی نبوده و یا پس از گرده افشانی موفق به تولید بذر نیستند استفاده از تکنولوژی کشت بافت می تواند موانع موجود را در ایجاد ژنوتیپهای مناسب برداشته و امکان ایجاد گیاهان هیبرید و یا گیاهانی با ژنهای مقاومت به آفات و بیماریها را فراهم آورد. یکی از روش های بسیار مناسب برای این منظور، استفاده از پروتوپلاست می باشد. پروتوپلاست گیاهان را می توان جهت انتقال مستقیم DNA و یا ژن به آن از طریق الکتروپوریشن^[۴] و یا پلاسمید Ti استفاده نمود. برای نیل به چنین اهدافی اولین قدم این است که اولاً بتوان تعداد مناسبی پروتوپلاست زنده و فعال از گیاه جداسازی نمود و ثانیاً بایستی سیستم باززایی گیاه کامل از کشت پروتوپلاست نیز برای گیاهان تعریف گردد. عدم دسترسی به موارد فوق مانع انجام مراحل بعدی در انتقال ژن می باشد(احسانپور وامینی، ۱۳۸۲).
جداسازی پروتوپلاست برای مطالعات گوناگون متعددی به کار می رود که شامل: عملکرد غشاء، ساختار سلول سنتز تولیدات مربوط به داروسازی و ارزیابی سم شناسی می باشد(Bajaj, 1989; Davey et al., 2005).
۱-۴ اتیلن به عنوان یک هورمون گیاهی
در طول قرن ۱۹، زمانی که گاز حاصل از ذغال سنگ جهت روشنایی خیابانها استفاده می شد، مشاهده می گردید درختانی که در مجاورت لامپ های خیابانی قرار داشتند برگهای آنها با شدت بیشتری نسبت به سایر درختان ریزش می نمایند. سرانجام مشخص گردید که ذغال سنگ و آلودگی هوا بر رشد و نمو گیاهان اثر می گذارد و اتیلن به عنوان ترکیب فعال گاز ذغال سنگ شناسایی گردید .(Taiz and Zeiger, 2002)
اتیلن تقریباً به وسیله تمام قسمتهای گیاهان عالی تولید می شود، اگر چه میزان تولید اتیلن به نوع بافت و مرحله نموی آن بستگی دارد. به طور کلی، مناطق مریستمی و گره ای از نظر بیوسنتز اتیلن فعال ترین قسمتهای گیاه هستند. همچنین تولید اتیلن در حین ریزش برگ، پیری گل و رسیدن میوه افزایش می یابد. هر نوع زخم نیز می تواند بیوسنتز اتیلن را القاء کند. همانطور که تنشهای فیزیولوژیکی مانند غرقابی، سرما، بیماری و گرما یا تنش خشکی نیز آن را القا می نماید.
آمینو اسید متیونین پیش ساز اتیلن است و ACC (1- آمینوسیکلوپروپان ۲- کربوکسیلیک اسید) به عنوان ترکیب حد واسط در تبدیل متیونین به اتیلن عمل می نماید. اتیلن به آسانی از بافتهای گیاهی آزاد و در بخش گازی فضاهای بین یاخته ای و بیرون از بافت منتشر می گردد.(Taiz and Zeiger, 2002)
۱-۴-۱ اثرات فیزیولوژیکی اتیلن در گیاهان
هیدروکربن ساده ی اتیلن(C2H4) نقش های متعددی را در رشد، نمو وتمایز گیاهان حتی در غلظت های کم دارد. این اثرات بسته به نوع و گونه ی گیاهان و یا اندام ها و بافت های مختلف، متنوع است.(Taiz and Zeiger, 2002) برخی از آثار نحریک کننده و یا بازدارنده ی رشد و نمو توسط اتیلن در گیاهان عبارتند از:
اتیلن و تقسیم سلولی در گیاهان
مطالعات مشخص کرد که اتیلن سبب کاهش چشمگیر تقسیم سلولی در کشت های سوسپانسیون شکر(Taylor et al., 1994) و کالوس برنج(Adkins et al., 1993) می گردد. گمان می رود کاهش القاء شده در تقسیم میتوز توسط اتیلن به دلیل دخالت در جهت گیری میکروتوبول های سلولی در طول تقسیم باشد(Steen and Chadwick, 1981).
اتیلن و تمایز سلولی^[۵]
بیشتر مطالعات صورت گرفته در شرایط in vitro در زمینه ی اثر اتیلن بر روی تمایز سلولی، در ارتباط با فرایند چوبی شدن^[۶] صورت گرفته است. غلظت های کم اتیلن چوبی شدن را تحریک می کند(Kumar et al., 1998). در نهایت می توان چنین گفت که اتیلن یک نقش مسلم در فرایند تمایز سلولی به صورت چوبی شدن در شرایط in vitro دارد.
اتیلن و تسریع در رسیدگی میوه
از مدت ها پیش اتیلن به عنوان هورمون تسریع کنندگی میوه شناخته شده و افزایش میزان تولید آن با شروع رسیدگی میوه مشاهده شده است. کاربرد مهار کننده های بیوسنتز و یا فعالیت اتیلن سبب تاخیر در رسیدگی میوه می گردد (Taiz and .Zeiger, 2002) در تیمار میوه های نارس کلیماکتریک نظیر سیب، موز، گوجه فرنگی و آووکادو با اتیلن، افزایش فرایند کلیماکتریک تسریع می گردد( کلیماکتری مرحله ای از نمو میوه است که در آن سرعت تنفس بالا می رود) و رسیدگی این میوه ها به وسیله ی افزایش کلیماکتریک در تنفس قابل تشخیص است که در این حالت آزادسازی CO2 نیز بیشتر می گردد (Taiz and Zeiger, 2002).
اتیلن و ریزش^[۷]
افتادگی برگ، میوه، گل و سایر اندام های گیاهان ریزش نامیده می شود که با ضعیف شدن دیواره ی سلولی در لایه ی ریزش به کمک آنزیم های تخریب کننده دیواره ی سلولی مانند سلولاز و پلی گالاکتوروناز صورا می گیرد.(Taiz and Zeiger, 2002) این فرایند پاسخی است که برخی گونه های گیاهی در برابر سطوح افزایش یافته ی اتیلن می دهند. تحقیقات نشان داده اند که تیمار بادمجان با ۱ یا ۱۰ ppm اتیلن، برای دو روز در ۲۰ درجه ی سانتی گراد زمان ذخیره سازی آن ها را به ترتیب ۳۳ یا ۲۵ درصد نسبت به میوه های کنترل کاهش می دهد(Kader, 1985). گفتنی است بیوسنتز اتیلن در ناحیه ی ریزش توسط کاهش اکسین تنظیم می گردد.(Taiz and Zeiger, 2002)
اتیلن و پاسخ های ریخت زایی
نقش اتیلن در تکثیر و ریخت زایی گیاهان بحث آمیز است(Arigitia et al., 2003). بررسی ها از نقش اتیلن در پاسخ های ریخت زایی گیاهان در شرایط in vitro خبر می دهد(Kumar et al., 2007). ارتباط اتیلن و برخی مسیر های شکل زایی مهم مانند تشکیل و رشد جوانه های جانبی(Gonzalez et al., 1997)، نمو ریشه (Pan et al., 2002) مطالعه شده است. حضور مقادیر کمی از اتیلن برای تشکیل ریشه های جانبی و رشد Lycopersicon esculentun لازم است(Mensuali-Sodi et al., 1995).