۲-۲-۱- اهداف اصلی طرح
بررسی میزان فراوانی آنزیم متالوبتالاکتاماز در سویه‌های سودوموناس ائروژینوزای جدا شده از نمونه‌های بالینی در شهر یزد
۲-۲-۲- اهداف ویژه طرح

1. 1. فراوانی نسبی آنزیم MBL در سویه‌های P. aeruginosa.

1. 1. فراوانی نسبی آنزیم MBL در سویه‌های P. aeruginosaبر حسب نوع نمونه.

1. 1. فراوانی نسبی آنزیم MBL در سویه‌های P. aeruginosaبر حسب بخش.

1. 1. فراوانی نسبی آنزیم MBL در سویه‌های P. aeruginosaبر حسب سن.

1. 1. فراوانی نسبی آنزیم MBL در سویه‌های P. aeruginosaبر حسب جنس.

1. 1. فراوانی نسبی مقاومت سویه‌های P. aeruginosaبه آنتی بیوتیک‌های مختلف به روش دیسک دیفیوژن .

۲-۳- سؤالات و فرضیات

1. 1. فراوانی نسبی آنزیم MBL در سویه‌های P. aeruginosaمتفاوت است.

1. 1. فراوانی نسبی آنزیم MBL در سویه‌های P. aeruginosaبر حسب نوع نمونه متفاوت است.

1. 1. فراوانی نسبی آنزیم MBL در سویه‌های P. aeruginosaبر حسب بخش متفاوت است.

1. 1. فراوانی نسبی آنزیم MBL در سویه‌های P. aeruginosaبر حسب سن متفاوت است.

1. 1. فراوانی نسبی آنزیم MBL در سویه‌های P. aeruginosaبر حسب جنس متفاوت است.

1. 1. فراوانی نسبی مقاومت سویه‌های P. aeruginosaدر آنتی بیوتیک‌های مختلف متفاوت است.

۲-۴- نوع و روش مطالعه
مطالعه از نوع توصیفی – تحلیلی بود که به روش مقطعی می‌باشد که با بهره گرفتن از روش سرشماری، تمام نمونه‌ها مشتمل بر P. aeruginosa جمع آوری شده از بیمارستان‌های شهید صدوقی ، شهید رهنمون و سوانح سوختگی استان یزد مورد ارزیابی قرار گرفتند.
جامعه مورد بررسی و خصوصیات افراد مورد مطالعه:
جامعه مورد بررسی کلیه سویه‌های P. aeruginosa به دست آمده از بیماران بستری در بیمارستان‌های شهید صدوقی و شهید رهنمون و بیمارستان سوانح سوختگی استان یزد می‌باشد که از اسفند ۹۱ تا اسفند ۹۲ جمع آوری شده اند.
۲-۵- روش کار
۲-۵-۱- انواع محیط کشت
تمامی محیط‌های کشت بصورت آماده و به شکل پودر موجود بودند. ابتدا طبق دستور العمل کارخانه سازنده آن ونوشته بر روی جعبه ، مقدار معینی از پودر را وزن کرده و با مقدار معینی آّب مقطر مخلوط کرده وتوسط حرارت خوب حل شد. سپس محیط کشت به مدت ۱۵ دقیقه در دمای ۱۲۱ درجه سانتی گراد و فشار ۱۵ پاند بر اینچ مربع اتوکلاو شد و درون پلیت استریل در مجاور شعله پخش شد. محیط‌هایی که باید در لوله باشند ابتدا در لوله ریخته سپس اتوکلاو شدند. جهت کشت از محیط EMB، مک کانکی و جهت تعیین هویت باکتری ازمحیط‌های Triple Suger Iron Agar ، SIM(برای حرکت ، اندول ، SH2)، MR-VP، Oxidative Fermentative و سیمون سیترات استفاده شد. بعد از کشت و نگهداری به مدت ۱۸-۲۴ ساعت در حرارت ۳۷ درجه سانتی گراد با مشاهده تغییر رنگ محیط ، نتیجه مثبت یا منفی مشخص گردید.
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

۲-۵-۲- مکانکی آگار(Mac Conkey agar)
این محیط برای کشت باسیل های گرم منفی مفیداست و محتوی نمک صفراوی است تا باکتری‌های غیر روده ای را مهار کند و نیز برای تشخیص کلی فرم‌های تخمیر کننده لاکتوز از سالمونلاهای غیر تخمیر کننده لاکتوز و گروه‌های دیسانتری، حاوی لاکتوز با قرمز خنثی (Nautral red) است. می‌توان غلظت توروکولات سدیم را کاهش داد . تا برای ارگانیسم‌هایی که تحمل کمتری دارند مناسب باشد. حذف کلریدسدیم از محیط، از گسترش کلونی‌های پروتئوس جلوگیری می‌کند . باکتری‌های تخمیر کننده ی لاکتو )لاکتوز مثبت‌ها( کلنی‌هایی به رنگ ارغوانی و باکتری‌هایی که قادر به تخمیر نیستند)لاکتوز منفی‌ها) کلنی‌هایی بی رنگ ایجاد می‌نمایند . رنگ ارغوانی کلنی‌های باکتری‌های لاکتوز مثبت مربوط به واکنش اسیدی است که در نتیجه تخمیر قند لاکتوز در مجاورت املاح صفراوی و جذب نوترال رد حاصل شده است. معرف نوترال رد در محیط قلیایی بی رنگ و در محیط اسیدی قرمز رنگ است این محیط کشت برای ایزولاسیون کلنی های P.aeruginosa مورد استفاده قرار گرفت [۶۷].
۲-۵-۳- محیط کشت ^[۳۷]SIM 
در این محیط کشت سه آزمایش تولید SH2 ، تولید ایندول از تریپتوفان و حرکت باکتری بررسی گردید. ایندول مثبت با ریختن ۵ قطره معرف کواکس بر روی کشت ۲۴ ساعته در این محیط و ایجاد رنگ ارغوانی نتیجه گیری شد . در مورد باکتری ایندول منفی ، بعد از ریختن معرف تغییر رنگی حاصل نشد .آخرین مولفه یعنی حرکت مثبت نیز با ایجاد کدورت یکنواخت در محیط کشت مشخص شد . سودوموناس‌ها متحرکند و رشد باکتری بصورت حلقه‌ای در اطراف لوله مشاهده گردید.
ایجاد سولفید هیدرژن توسط باکتری به صورت سیاه شدن ظاهر می‌گردد و در صورت متحرک بودن باکتری کشت شده، سیاهی نیز تمام محیطی که باکتری پخش گردیده است، انتشار می‌یابد. سیاه شدن محصول واکنش هیدروژن سولفوره تولید شده با سولفات آهن و تشکیل رسوب سولفوره آهن سیاه رنگ می‌باشد. با اضافه کردن یک میلی لیتر معرف کواکس(Kovac`s) به کشت ۲۴ ساعته، ظهور رنگ ارغوانی در سطح کشت دلیل بر تولید اندول توسط باکتری است. باکتری‌های که حاوی مجموعه آنزیم‌هایی که اصطلاحا تریپتوفاناز نامیده می‌گردند، باشند، قادرند طی یک سری واکنش‌های شیمیایی تریپتوفان را اکسیده و اندول استیک تولید نمایند [۶۸].
۲-۵-۴- روش آماده سازی معرف کواکس جهت تست اندول
فسفو دی متیل آمینو بنزآلدئید    ——————   ۵ گرم
ایزو آمیل الکل                      ——————  ۷۵ میلی لیتر
اسید کلریدریک                   ——————-  ۲۵ میلی لیتر
آلدئید را در الکل به آرامی حل واز بن ماری ۵۵-۵۰ درجه سانتیگراد استفاده گردید و به آن اسید اضافه و دور از نور و در ۴ درجه سانتیگراد نگهداری شد . رنگ معرف باید از زرد روشن تا قهوهای روشن باشد [۳].
۲-۵-۵- محیط کشت ^[۳۸]OF
با کشت باکتری در این محیط می‌توان مشخص نمود که استفاده باکتری از کربوهیدرات از طریق اکسیداسیون یا از طریق تخمیر صورت گرفته است. از این محیط دو عدد، یکی حاوی پارافین و دیگری فاقد پارافین تهیه کرده و نمونه در هر دو محیط کشت داده شد. باکتری P. aeruginosa تنها از طریق اکسیداسیون از قند گلوکز استفاده کرد، در لوله فاقد پارافین، محیط اسیدی شده، که در مجاورت معرف بروموتیمول بلو به رنگ زرد در آمد. رنگ زرد از بالای لوله شروع شد. اگر باکتری از طریق فرمنتاتیو قندها را تخمیر نماید، در هر دو لوله کشت (حاوی پارافین و فاقد پارافین) بر اثر تولید اسید رنگ زرد دیده شد [۳].
۲-۵-۶- محیط کشت TSI^[39]
محیط TSI حاوی معرف فنل ـ رد ، سولفات فرو ، تیو سولفات سدیم ( برای تشخیص تولید گاز سولفید هیدروژن ) و سه قند گلوگز ، لاکتوز و سوکروز است که غلظت گلوکز درمحیط ۱/۰ غلظت دو قند دیگر می‌باشد . این محیط قبل از کشت به دلیل داشتن معرف فنل ـ رد قرمز رنگ است . با بهره گرفتن از TSI سه خصوصیت در یک باکتری مشخص گردید. الف : توانایی تولید گاز CO2 , H2 از متابولیسم قندها . ب : توانایی تولید مقادیر زیادی گاز سولفید هیدروژن که از طریق سیاه شدن محیط. باکتری در این محیط با بهره گرفتن از تیو سولفات سدیم H2S تولید کرد که با املاح آهن موجود در محیط رسوب سیاه رنگ ایجاد کرد.
ج : توانایی تخمیر گلوکز ، لاکتوز و سوکروز . در صورت تخمیر قند با تولید CO2 ، حباب و ترک خوردن و حتی جابجایی محیط مشاهده می‌گردد. با تخمیر قند تمام لوله اسیدی شد و محیط کشت به رنگ زرد در می‌آید و درغیر این صورت تمام لوله قلیایی می‌شود و تغییر رنگی صورت نمی گیرد. باکتری P. aeruginosa قادر به تخمیرقند نبوده و محیط کشت به رنگ قرمز باقی ماند [۳].
۲-۵-۷- محیط سیمون سیترات^[۴۰]
حاوی نمک‌ها، کاتیون‌ها، بافرهای سیترات و بروم تیمول آبی به عنوان اندیکاتور است، می‌تواند در pH قلیایی ( بالاتر از ۶/۷ ) و در جریان تولید ترکیبات قلیایی (ترکیبات آمونیوم ) حاصل از مصرف سیترات تولید رنگ آبی درمحیط نماید. باکتری به صورت سطحی کشت داده شد. بعد از ۲۴ ساعت باکتری از منبع کربن استفاده کرد ، رنگ محیط آبی شد ودر غیر این صورت رنگ محیط تغییری نکرده و رشدی نیز مشاهده نگردید [۳].
۲-۵-۸- محیط مایع^[۴۱]( ( MR-VP
یک کلنی از باکتری تلقیح شد و به مدت حداقل ۴۸ ساعت در ۳۷ درجه سانتی گراد گذاشته شد. مقدار ۵/۲ میلی لیتر از این مایع به لوله دیگر جهت آزمایش VP منتقل گردید.
آزمایش VP: به لوله کشت داده شده و انکوبه شده حدود۶ /۰ میلی لیتر معرف آلفا نفتول معرف (A) و مقدار ۲/۰ میلی لیتر محلول پتاس معرف(B) اضافه گردید و خوب تکان داده اگر تغییر رنگ صورت نگرفت آنرا به مدت سی دقیقه به حال خود گذاشته و در صورتی که ظهور رنگ صورتی تا قرمز پدیدار شود، آزمایش VP مثبت و اگر تغییر رنگی صورت نپذیرد و در صورت عدم تغییر رنگ منفی گزارش شد.
۲-۵-۹- طرز تهیه معرف VP
معرف A :
۱-آلفانفتول  ————-  ۵ گرم
۲-الکل اتلیک مطلق——-  ۱۰۰ میلی لیتر