روش حساس تری نسبت به کشت می باشد زیرا این روش بر پایه آنتی ژن های باکتری های زنده انجام می شود که با آنتی بادی اختصاصی خود واکنش می دهد .

نتایج در این روش تحت تاثیر مصرف آنتی بیوتیک ها قرار نمی گیرد. همچنین این روش سریع تر از روش کشت بوده و قادر به تمایز سروتایپ های مختلف کپسول دار می باشد. با این حال نتایج آن نسبت به روش مولکولی از دقت کمتری برخوردار است (۳۵).
۱-۸-۳: روش مولکولی
واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) بسیار حساس تر، اختصاصی تر و سریع تر از روش کشت و LAT می باشد (۳۵،۵۱). طراحی پرایمر برای شناسایی مولکولی سروتایپ های هموفیلوس آنفلونزا برای اولین بار در سال ۱۹۹۰ توسط وَن کِتِل^[۱۷] و همکاران انجام شد (۷۱). با این حال روش PCR هنوز به صورت روتین در آزمایشگاه ها مورد استفاده قرار نمی گیرد.
۱-۹: ژنوم هموفیلوس آنفلونزا:
هموفیلوس آنفلونزا اولین موجود زنده دارای توانایی تکثیر مستقل است که ژنوم آن به طور کامل تعیین توالی شد. پروژه ژنوم هموفیلوس آنفلونزا در سال ۱۹۹۵ توسط ونتر^[۱۸] همکاران انجام شد.
هموفیلوس آنفلونزا به این دلیل انتخاب شد که یکی از سرپرست های پروژه به نام همیلتون اسمیت^[۱۹] (برنده نوبل) یک دهه بر روی این میکروارگانیسم کار کرده بود و اطلاعات زیادی در مورد آن وجود داشت که برای موفقیت پروژه لازم بود.
ژنوم هموفیلوس آنفلونزا در یک کروموزوم حلقوی قرار گرفته که دارای ۱۸۳۰۱۳۷ جفت باز است. این تعداد نوکلئوتید تشکیل ۱۷۴۰ ژن کد کننده پروتئین، ۲ ژن کد کننده tRNA و ۱۸ ژن کد کننده RNA را می دهد.
برای توالی یابی ژنوم از تکنیک shutgun sequencing استفاده شد. این پروژه یک سال طول کشید و در این مدت ۲۴۳۰۴ قطعه به صورت مجزا توالی یابی و سپس توسط نرم افزار کنار هم قرار داده شدند(۷۲).
شکل ۱-۶: نقشه ژنتیکی حلقوی Haemophilus influenza Rd
۱-۹-۱: ژنوم مولد کپسول پلی ساکاریدی
انواع هموفیلوس آنفلونزای کپسول دار دارای ژن های مشترک برای تولید کپسول پلی ساکارید^[۲۰] مربوط به خود هستند که در جایگاه cap (cap locus) قرار گرفته اند(۴۲).
جایگاه cap یک منطقه ۱۸kb است که در همه سروتیپ ها دارای سه منطقه عملکردی جداگانه به نام های منطقه I,II.III می باشد (شکل ۱-۷).

شکل ۱-۷: ساختار ژنتیکی جایگاه cap در هموفیلوس آنفلونزا سروتایپ های a,b,c,d,e,f
منطقه I و III در همه سروتایپ های کپسول دار مشترک است و شامل ژن هایی است که برای تولید و ترشح کپسول پلی ساکاریدی ضروری هستند. مشابه این ژن ها در باکتری های گرم منفی دیگر از قبیل
Escherichia coli, Neisseria meningitides, Actinobacillus pleuropnumoniae, Mannheimia haemolytica, Pasteurella multocida دیده شده است. (۶۳)
۱-۹-۱-۱: منطقه I
منطقه I دارای چهار ژن به نام های bexA,B,C,D می باشد که برای تولید سیستم ترشح کپسول وابسته به ATP کد می شوند و در انتقال پلی ساکارید به سطح سلول باکتری نقش دارد (۴۱) (شکل۱-۸).
۱-۹-۱-۳: منطقه II
منطقه II دارای چهار ژن بوده و در هر سروتایپ منحصر به فرد است^[۲۱] و آنزیم های کد شده توسط این منطقه باعث تولید دی ساکارید اختصاصی هر سروتایپ می شود(۲۸،۷۰).
این ژنها در Hib به نام های bcs1,2.3.4 شناخته میشوند. حرف اول (b) نشان دهنده نوع سروتایپ می باشد و سروتایپ های دیگر نیز به همین ترتیب نام گذاری می شود(شکل ۱-۸).
۱-۹-۱-۲: منطقه III
منطقه III شامل دو ژن به نام های hcsA و hcsB می باشد که به نظر می رسد در مراحل پلیمریزاسیون کپسول و حتی در اصلاحات و ترشح پلی ساکارید نقش داشته باشند (۲۹)(شکل ۱-۸).
مطالعه سوکوپولوی^[۲۲] و همکاران در سال ۲۰۰۶ نشان داد این دو ژن به صورت مکمل در تسهیل انتقال کپسول پلی ساکاریدی به سطح سلول و ویرولانس باکتری نقش دارند. غیر فعال کردن این ژن ها به صورت جدا از هم و همزمان در این مطالعه باعث تجمع پلی ساکارید در فضای پری پلاسمی سلول باکتری شد(۶۷).
۱-۹-۱-۴: قطعه IS1016 ^[۲۳]
همه سروتایپ ها حداقل یک کپی کامل از جایگاه cap دارند که به یک قطعه به نام IS1016 متصل است. در سوش های دارای بیش از یک کپی ، دو قسمت توسط یک قطعه IS1016 از هم جدا شده اند. یعنی به ابتدای هر جایگاه cap کامل یک قطعه IS1016 متصل است(۵۷) (شکل ۱-۱۱).
قطعه IS1016 باعث سهولت در مضاعف شدن جایگاه cap در طول همانند سازی کروموزوم های خواهری، تحت تحت اثر نوترکیبی نامساوی می شود.
این قطعه در اغلب سویه ها به جایگاه cap متصل بوده و گفته می شود در یک سویه اجدادی از طریق جابه جایی^[۲۴] به وجود آمده است.
این عناصر باعث جابه جایی جایگاه cap به عنوان یک ترانسپوزون در درون کروموزوم می شود و می تواند باعث تکثیر جایگاه cap در طول نوترکیبی همولوگ شده و منجر به افزایش تولید کپسول شود.
حذف شدگی در یکی از قطعات IS1016 به همراه بخشی از ژن bexA در Hib باعث ایجاد پایداری در ساختار دوتایی جایگاه cap می شود(۳۴). این حذف شدگی باعث جلوگیری از حذف کپی دیگر bexA در طول نوترکیبی می شود. سویه های دارای حذف شدگی در تمام دنیا گسترش پیدا کرده و در حال حاضر عامل اغلب عفونت های ایجاد شده توسط Hib هستند. به همین دلیل به نظر می رسد حذف شدن این قطعه ۱٫۲kb در سویه اجدادی یک نوع برتری زیستی به باکتری اعطا کرده است(۴۰).
شکل ۱-۸: جایگاه cap و ژن های تشکیل دهنده
۱-۹-۱-۵: تعداد کپی جایگاه cap^[25]
ساختارهای ژنتیکی تولید کننده کپسول Hib بارها مورد بررسی قرار گرفته است. این جایگاه به نام cap locus یا جایگاه cap شناخته می شود. در بیشتر موارد Hib دارای یک توالی دوتایی ناقص از جایگاه cap است اما در مواردی حتی تا ۶ کپی از این جایگاه نیز گزارش شده است(۱۹) . این دو جایگاه کاملا در مناطق II و III مشابه هم هستند، یکی از کپی ها دارای منطقه I کامل و دیگری معمولا دارای یک حذف شدگی به اندازه ۱٫۲kb در منطقه I می باشد.، که این حذف شامل بخشی از ژن bexA و IS1016 می شود. به عبارتی یک کپی کامل به اندازه ۱۸kb و یک کپی ناقص با حذف شدگی وجود خواهد داشت(۶۳).
این آرایش دوتایی ناقص به باکتری اجازه تکثیر بیشتر ژن کپسول و در نتیجه افزایش تولید پلی ساکارید کپسولی را می دهد که باعث افزایش شدت بیماری زایی Hib می شود(۵۷) .
تصور می شود وجود IS1016-bexA ناکامل در انتهای یکی از جایگاه ها به دلیل ایجاد ثبات در تولید کپسول با کاهش احتمال نوترکیبی می باشد.