۱-۹-۱-۳- مکانیسم بیماری زایی UPEC در ارتباط با افمبریال ادهسین (afa, foc, sfa, fim, pap,):
UPEC دارای فاکتورهای اتصالی هستند به نام پیلی یا فیمبریه، که به آنها اجازه می دهد تا به طور موفقیت آمیزی عفونت را آغاز کنند (تیبا و همکاران، ۲۰۰۸).ادهسین ها آنتی ژن های فیمبریالی هستند که باکتری را قادر می سازند تا به موکوس روده متصل شود (مولوی، ۲۰۰۲). از ادهسین های معمول موجود در اشرشیا کلی یوروپاتوژن می توان به P فیمیریا، فیمبریا نوع ۱، S فیمبریا، FIC فیمبریا و خانواده ادهسین Dr و ادهسین های افمبریال می باشد، نام برد. این فیمبریه ها به ترتیب توسط ژنهای(Afa, foc, sfa, Fim, Pap) کد می شوند (میازاکی و همکاران، ۲۰۰۲). در UPEC، فیمبریا نوع ۱ مهمترین عامل حدت است. تعدادی از اعضای خانواده انتروباکتریاسه این ژن را تولید می کنند. فیمبریه نوع ۱ به وسیله بیش از ۹۰% سویه های اشرشیا کلی بیان می شود. این فیمبریه اتصال به گلیکو پروتئین های ترشح شده و گلیکو پروتئین های مانوزیله شده ای را که به سلول متصل شده اند وساطت می کند. P-فیمبریه، ضمائم هتروپلی مریک سخت میله مانندی هستند که از سطح سلول اشرشیا کلی بیرون زده اند و نشان داده شده است که در بیشتر از ۷۰% اشرشیا کلی پیلونفریتوژن حضور دارد(چورمک، ۲۰۰۶). FIC فیمبریه به وسیله کلاستر ژن foc کد می شود، یک فاکتور اتصالی غیر هماگلوتینه کننده است که به وسیله تقریباً ۱۴% از اشرشیا کلی ایجاد کننده عفونت دستگاه ادراری و ۷% از سویه های مدفوعی اشرشیا کلی بیان می شود. این فیمبریه از نظر ژنتیکی مشابه S فیمبریه است اما از نظر اختصاصیت رسپتورهایشان با یکدیگر متفاوتند(ناظمی و همکاران، ۲۰۱۰). S-فیمبریه به رسپتورهای حاوی بخش های قندی اسید سیالیک متصل می شود و در اشرشیا کلی ایجاد کننده سپتیس و پیلونفریت حضور دارد(مولوی، ۲۰۰۲). افمبریال ادهسین ها از نظر خصوصیات مورفولوژی و بیوشیمیایی با دیگر ادهسین ها تفاوت دارند و توسط ژن afa کد می گردند و نشان داده شده است که در ایجاد عفونت دستگاه ادراری دارای نقش می باشند (تصویر شماره ۱-۲).
تصویر شماره (۱-۲): شکل شماتیک از نحوه اتصال باکتریE.coli به سطح سلول های اپیتلیال سطحی بدن
۱-۹-۱-۴- مکانیسم بیماری زایی UPEC در ارتباط با سایتوتوکسیک نکروز دهنده(cnf):
سویه های بیماری زا قابلیت تولید و نمود طیف وسیعی از عوامل حدت را دارند که بر این اساس به پاتوتیپ های مختلفی از جمله انتروتوکسیژن(ETEC)، نکروتوکسیژنNTEC))، تولید کننده شیگا توکسین(STEC) و غیره تقسیم می شوند. سویه های نکروتوکسیژن(NTEC) برای اولین بار دراسهال نوزادان گزارش شد(اولت و همکاران، ۲۰۰۷). در میان محصولات، سیتوتوکسیک نکروز دهنده CNF1),(CNF2)) ممکن توکسین های دیگری نظیر توکسین های تورم دهنده کشنده سلول (CDT)، همولیزین (hly)، P – فیمبریه (pap)، افمبریال ادهسین (afa)، Sفیمبریه (sfa)و …باشند. سویه های نکروتوکسیژن قادرند عامل سیتوتوکسیک نکروز دهنده (CNF) تولید کنند که موجب چند هسته ای شدن سلول ها در کشت سلول و نکروز پوست خرگوش می گردد(الکس و همکاران، ۲۰۰۱).در سویه های اشرشیا کلی نکروتوکسیژن جدا شده از عفونت های مختلف انسان ودام ها سه نوع از توکسین های مذکور تحت عنوان عامل سیتوتوکسیک نکروز دهنده ۱و۲و۳ CNF1, CNF2 ,CNF3)) شناسایی و گزارش شده است. عامل سیتوتوکسیک نکروز دهنده ۲و۱ پروتئین های مقاوم به حرارت بوده و از نظر وزن مولکولی تقریباً مشابه می باشند و توالی نوکلئوتیدی ژن های کد کننده آنها ۷/۸۵ درصد مشابهت با یکدیگر را نشان می دهند(بلنکو وهمکاران،۱۹۹۳; بلنکو و همکاران، ۱۹۹۸). سویه های نکروتوکسیژن( NTEC1 و NTEC2 ) که به ترتیب عوامل سیتوتوکسیک نکروز دهنده ۱و۲ را تولید می کنند از نظر ژنتیکی و ساختار آنتی ژنی به یکدیگر شباهت داشته و متعلق به گروه های سرومی یا سروتیپ های مختلف می باشند(اسواد و همکاران، ۱۹۹۴; آماویزیت و همکاران، ۲۰۰۱). ژن کد کننده عامل سیتوتوکسیک نکروز دهنده ۱ بر روی کروموزوم باکتری قرار داشته و معمولاً با ژن های کد کننده همولیزین و فیمبریه های P و S همراه است. سویه های نکروتوکسیژن ۱ تاکنون از موارد عفونت های گوارشی نشخوارکنندگان، خوک، سگ و همچنین از عفونت های خارج گوارشی (نظیر عفونت های ادراری) انسان جدا شده است(توت و همکاران، ۲۰۰۱; ون و همکاران، ۲۰۰۱). ژن کد کننده عامل سیتوتوکسیک نکروز دهنده ۲ بر روی پلاسمیدی به نام Vir قرار دارد و ممکن است با اپران های کد کننده عوامل فیمبریه ای F17 و یا غیر فیمبریه ای Afa8 همراه باشد اما سویه های نکروتوکسیژن ۲ عمدتاً از نشخوارکنندگان با علائم عفونت گوارشی یا سپتی سمی جدا می گردد. عامل سیتوتوکسیک نکروز دهنده ۳ که به تازگی در جدایه های اشرشیا کلی از بره و بزغاله های سالم و بیمار شناسایی شده است دارای مشابهت هایی با عوامل ۱و۲ است(الکس و همکاران،۲۰۰۱)^۱. ژن کد کننده این فاکتور بر خلاف ژن های عامل سیتوتوکسیک نکروز دهنده ۱و۲ با ژن های کد کننده انتیمین و انتروهمولیزین همراه است. در سال های اخیر توکسین های تورم دهنده کشنده سلول (CDTs) در سویه های مختلف اشرشیا کلی شناسایی شده است که شامل ۴ واریانت می باشد این توکسین ها موجب توقف تقسیم سلولی در مرحله G2/M می شوند. توکسین های تورم دهنده کشنده سلول نوع ۱و۲ (CDT-I,CDT-II) از نظر وابستگی با سویه های نکروتوکسیژن مورد توجه نیستند اما دسته ژن های کد کننده توکسین تورم دهنده سلول نوع ۴ (CDT-IV) بر روی کروموزوم قرار دارند و به همین دلیل همواره با عامل سیتوتوکسیک نکروز دهنده ۱ همراه است(نعمتی و همکاران، ۲۰۱۲). در حالی که دسته ژن های کد کننده نوع ۳ (CDT-III) بر روی پلاسمید Vir قرار داشته و به همراه عامل سیتوتوکسیک نکروز دهنده ۲ شناسایی می گردد. تاکنون حضور توکسین های تورم دهنده کشنده سلول در سویه های نکروتوکسیژن نوع ۳ گزارش نشده است. به تازگی دسته پنجمی از توکسین های تورم دهنده کشنده سلول در سویه ای انتروپاتوژنیک جدا شده از دام ها شناسایی و گزارش شده است که با ژن شیگا توکسین همراه است(توچان و همکاران، ۲۰۰۹)^۲.^[۳۰]
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

شیوع ژن تولید کننده CNF در اشرشیا کلی مرتبط با عفونت ادراری به طور گسترده ای گزارش شده است. علاوه بر این، شرایط میزبان مانند سن بالا و زمینه هایی مانند انسداد مجاری ادراری، دیابت شیرین و ضعف مثانه به کلونیزاسیون باکتری کمک کرده و نقش مهمی در عفونت ادراری دارد(گالز و همکاران، ۲۰۰۲; یولرد، ۲۰۰۳). تحقیقات نشان می دهد که شیوع فاکتورهای ویرولانس در سویه های UPEC با پاتوژنیسته ادراری در ارتباط است، سویه های UPEC انواع مختلف توکسین ها مانند همولیزین و CNF1 را تولید می کنند تا محیط داخل بدن میزبان را برای ایجاد عفونت آماده کنند. معمولاً بیان این دو توکسین در راستای یکدیگر و نزدیک به هم هستند.
۱-۹-۱-۵- مکانیسم بیماری زایی UPEC در ارتباط با همولیزین(hlyA):
دو نوع همولیزین توسط اشرشیا کلی تولید می شود : ۱) نوع ترشحی ۲) متصل به سلول
آنها گلبول های سرخ و سفید را پاره کرده و ممکن است از عمل بیگانه خواری جلوگیری کند. سویه های بیماری زای اشرشیا کلی حاوی یک آندوتوکسین بوده که اثرات آن شبیه به سایر آندوتوکسین ها می باشد. همچنین این باکتری ها تولید نوع III سیستم ترشحی می کند تا بتواند مولکول های موثر را مستقیماً وارد سلول باکتری نماید. این سیستم همچنین می تواند سویه های تهاجمی اشرشیا کلی را وارد سلول های روده ای نماید. اتصال از طریق پیلی و فیمبریه و انتیمین صورت می گیرد فاکتورهای بیماری زایی که کمک به تهاجم باکتری و بیماری زایی آن می کند شامل کپسول می باشد (تصویر شماره ۱-۳)(تصویر شماره۱-۴).

تصویر شماره (۱-۳): شکل شماتیک از فاکتورهای ویرولانس در اشرشیا کلی
تصویر شماره (۱-۴): مکانسیم بیماری زایی UPEC
۱-۱۰-تعاریف واژه ها :
اشریشیا کلی : اشریشیا کلی باسیل گرم منفی، متعلق به خانواده انتروباکتریاسه، بدون اسپور و متحرک به وسیله تاژ های پیرامونی است.
تکنیک PCR (واکنش زنجیره ای پلیمراز) : این تکنیک مجموعه ای از واکنش های بیوشیمیایی است که در طی آن قطعه مشخصی از DNA به طور تصاعدی تکثیر می یابد، بدین ترتیب مقادیر انبوهی از DNA هدف ایجاد می گردد.
عفونت دستگاه ادراری (UTI) نوعی عفونت باکتریایی است که بر بخشی از دستگاه ادراری تأثیر می‌گذارد. هنگامی که عفونت دستگاه ادراری تحتانی را مبتلا می‌کند سیستیت ساده (عفونت مثانه) نامیده می‌شود و هنگامی که بر دستگاه ادراری فوقانی تأثیر می‌گذارد به آن پیلونفریت (عفونت کلیه) گفته می‌شود.
ویرولوتایپینگ: دسته بندی تیپ های باکتری بر اساس وجود یا عدم وجود ژن های ویرولانس و بررسی رابطه خویشاوندی آنها می باشد.
سیستیت : نوعی عفونت باکتریایی است که بر بخشی از دستگاه ادراری تأثیر می‌گذارد. هنگامی که عفونت دستگاه ادراری تحتانی را مبتلا می‌کند سیستیت ساده (عفونت مثانه) نامیده می‌شود.
پیلونفریت : نوعی عفونت باکتریایی است که بر بخشی از دستگاه ادراری تأثیر می‌گذارد. هنگامی که بر دستگاه ادراری فوقانی تأثیر می‌گذارد به آن پیلونفریت (عفونت کلیه) گفته می‌شود.
فصل دوم
مروری بر تحقیقات انجام شده
۲-۱- بررسی تحقیق های انجام شده:
Versalovic et al (1991) روش های تعیین اثر انگشت ژنوم باکتریها را بر اساس تکثیر عناصر تکراری با بهره گرفتن از PCR ارائه نمودند. بر اساس این دستاورد، عناصر تکراری DNA که به منظور تعیین اثر انگشت مورد استفاده قرار می گیرند بر ۳ نوع می باشند(ورسالویک و همکاران، ۱۹۹۱).
Versalovic et al (1994)عناصر تکراری محافظت شده به طول ۱۵۴ جفت باز به نام BOX، متشکل از ۳ جزء boxA, boxB, boxC (ورسالویک و همکاران، ۱۹۹۴).
در سال ۱۹۹۹، PETER و همکاران طی یک پروژه تحقیقاتی، یک پروتوکل Multiplex PCR به منظور شناسایی همزمان شیگا توکسین ۱ و ۲ (stx1 , stx2)، اینتیمین (eaeA) و همولایزین (EHEC hlyA) ارائه نمودند. این محققین با بهره گرفتن از این روش اقدام به شناسایی سریع سویه های E.coli بیماریزا در انواع نمونه های محیطی و کلینیکی نمودند(پیتر و همکاران،۱۹۹۹).
در سال ۱۹۹۹، Sharma و همکاران و در سال ۲۰۰۶، Heijnen و همکاران توانستند با بهره گرفتن از غنی سازی اولیه و متعاقباً شناسایی ژنهای ویرولانس با بهره گرفتن از تکنیک real-time PCR، با سرعت و ویژگی بالا اقدام به شناسایی انواع سویه های انتروپاتوژن E.coli در نمونه های نمایند(چریف و همکاران، ۲۰۰۳).
در سال ۲۰۰۰، PASS و همکاران اقدام به پاتوتایپینگ و شناسایی ۱۱ ژن ویرولانس E.coli اعم از LTI, LTIIa,، LTIIb، STI، STII، VT1، VT2,، VT2e, ، eaeA، Eagg و Einv پرداختند. این محققین اعلام نمودند که می توان با استناد به این تکنیک، کلیه سویه های انتروپاتوژن E.coli را از یکدیگر تفکیک نمود (کمپبل و همکاران، ۲۰۰۱).
در سال ۲۰۰۰، در آمریکا مطالعه ای روی نمونه خون بیماران دچار اوروسپسیس نشان داد که traT یک ژن شایع در بیماران دارای نقص ایمنی و افراد با سیستم ایمنی کامل است(آندری و همکاران، ۲۰۰۸).
در سال ۲۰۰۱، Campbell و همکاران پروتوکل شناسایی سویه پاتوژن E.coli O157:H7 را در نمونه ها به صورت Multiplex PCR ارائه نمودند. این محقیقن پروتکل پیشنهادی خود را که بر اساس شناسایی ژنهای ویرولانس و ساختاری بود بسیار حساس و با ویژگی بالا معرفی کردند (تونی و همکاران، ۲۰۰۶).
در سال ۲۰۰۳، Fode و همکاران وCebula و همکاران اقدام به شناسایی مستقیم سویه های پاتوژن (بالاخص انتروهموراژن) E.coli از نمونه های ادراری و نیز بررسی بیماریزایی آنها در بیماران پرداختند. به ادعای این محققین، روش ارائه شده می تواند حساسیت و کارایی قابل قبولی در شناسایی مستقیم E.coli داشته باشد(فود و همکاران، ۲۰۰۳).
در سال ۲۰۰۶، Toni و همکاران با انجام چندین پروتوکل PCR (به صورت تک و مالتی پلکس)، ۵۸ ژن ویرولانس E.coli را در نمونه های کلینیکی مورد شناسایی و ارزیابی قرار دادند. مطابق نتایج حاصل از این تحقیق، راه انتقال سویه های پاتوژن E.coli به تعدادی از این بیماران آلوده به عفونت های ادراری بوده است (تونی و همکاران، ۲۰۰۶).

• در سال ۲۰۰۷، Bekal و همکاران و در سال ۲۰۰۹، Bruant و همکاران با بهره گرفتن از تکنیک ریزآرایه اقدام به شناسایی ژنهای ویرولانس پاتوتایپ های انتروپاتوژن E.coli نمودند (بکال و همکاران، ۲۰۰۷; برانت و همکاران، ۲۰۰۹).

• در سال ۲۰۰۷،Lan و همکاران که در دانشگاه میشیگان انجام شد، مشخص گردید که فیمبریه نوع I به مقدار زیادی در طول عفونت دستگاه ادراری بیان می گردد که این بیان می تواند منجر به کاهش حرکت در این باکتری گردد و این موضوع به عنوان یک عامل مهم در عفونت، به ویژه در ۲۴ ساعت از زمان کلونیزاسیون در مثانه، تلقی می گردد(لن و همکاران، ۲۰۰۹).

• در سال۲۰۱۰،Pina و همکاران، توانستند با طراحی یک مالتی پلکس PCR، عامل عفونی موجود در نمونه های ادراری را شناسایی نمایند. حسب نتایج این محققین مشخص شد که عامل عفونی E.coliسویه O157:H7 بوده است. ژنهایی که در این تحقیق مورد شناسایی قرار گرفتند عبارت بودند از stx1، stx2، wzyO157 و . eae.

• در سال ۲۰۱۱، Oliviera و همکاران در برزیل توانستند با طراحی یک مالتی پلکس PCR، عامل عفونی موجود در نمونه های ادراری را شناسایی نمایند(بلنکو و همکاران، ۲۰۰۳).

در سال ۲۰۱۲،Kudinha و همکاران در استرالیا با روش multiplex PCR-Bssed Reverse line Blot در ۷۷ درصد نمونه های افراد مبتلا به سیستیت ژن traT را شناسایی کردند(کپریلو و همکاران، ۲۰۰۵).
در سال ۲۰۱۲، Qin و همکاران روی سویه های E.coli نشان داد که هیچ کدام از ایزوله های جدا شده از موارد حاد سیستیت و یا پیلونفریت ژن afa را حمل نمی کنند(کوئین و همکاران، ۲۰۱۲).

• در سال ۲۰۱۳، ممتاز و همکاران مطالعاتی جهت بررسی فراوانی بالای ژن های حدت در باکتری اشرشیا کلی انجام دادند(ممتاز و همکاران، ۲۰۱۳).

• در سال ۲۰۰۰، Soto و همکاران مطالعاتی در خصوص فاکتورهای حدت یوروپاتوژن و عامل ایجاد آسیب به اپیتلیوم مجاری ادراری برشمرده شده بودند، نیز بیانگر توانایی های بالقوه باکتری های جداسازی شده برای ایجاد آسیب به نواحی بالای واژن زنان نازا انجام دادند(سوتو و همکاران، ۲۰۰۰).

• در سال ۱۳۹۲، نعمتی و همکاران مطالعاتی در خصوص بررسی فراوانی اشرشیا کلی یوروپاتوژن مولد عفونت ادراری و تعیین برخی ژن های ویرولانس در ایزوله های جدا شده از بیماران مراجعه کننده به بیمارستان شهید بهشتی کاشان انجام دادن.(نعمتی و همکاران ۱۳۹۲).

• در سال ۲۰۱۰، مطالعه ای توسط Mercon و همکاران روی بیماران پیوند کلیوی انجام شد، شیوع ژنaer 33 درصد گزارش شد(مرکون و همکاران، ۲۰۱۰).

در بررسی Birosova و همکاران فاکتورهای حدت hly, cnf-1, pap, sfa در سوش های اشرشیا کلی جداسازی شده از سواپ های واژنی زنان مبتلا به عفونت های ادراری، ردیابی شدند(بیروسوا و همکاران، ۲۰۰۴).
فصل سوم
مواد و روش ها
۳ -۱- نوع مطالعه:
مطالعه از نوع توصیفی بوده است.
۳-۲- جامعه مورد مطالعه :
جامعه مورد بررسی در این تحقیق شامل ایزوله های اشرشیا کلی یوروپاتوژن جدا شده در بیماران مبتلا به عفونت مجاری ادراری مراجعه کننده به بیمارستان بقیه الله (عج) تهران بود. تعداد ۱۰۰ ایزوله جدا شده اشرشیاکلی مورد بررسی قرار گرفت.
۳-۳- روش انجام طرح